益生性枯草桿菌Bacillus subtilis WG6-14在水稻栽培與病害管理上之應用性

摘要：為了探討枯草桿菌 (Bacillus subtilis ) WG6-14於育苗作業中對台稉8號(Oryza sativa L. cv. Tai-Keng 8; TK8) 及台稉9號 (Oryza sativa L. cv. Tai-Keng 9; TK9) 之應用性。將本實驗室所建立之醱酵量產技術所生產出來之枯草桿菌WG6-14醱酵菌液 (1010 endospores/ml) 經1~100倍稀釋後來取代25%撲克拉乳劑 (2000倍) 對稻種進行浸種處理24小時，以化學藥劑或清水做浸種處理為對照組 (CK)。可知施用WG6-14 50倍與100倍行浸種處理可以提早並增加水稻發芽率。然而將濃度提高至1倍與10倍，則會抑制胚根與胚軸的生長。於2005年台中市南屯區育苗場以WG6-14取代化學藥劑來處理供試稻種台稉8號與台稉9號，以WG6-14 50倍稀釋液比照化學藥劑施用方式對此兩稻種浸漬24小時，對照組則以清水行浸種處理，於處理後兩週調查其25 cm2內之秧苗數量，於處理組方面分別為165株 (TK8) 與137株 (TK9)，在對照組方面分別為110株 (TK8) 與113株 (TK9)。並測量秧苗高度，處理組平均株高分別為11.4 cm (TK8) 與14.1 cm (TK9)，在對照組則分別為10.4 cm (TK8) 與12.5 cm (TK9)。可由上述證實施用WG6-14對秧苗發芽及發育具有促進之功效。在育苗過程中發現施用WG6-14秧苗會有類似缺氮所造成的輕微黃化。在育苗土添加400 ppm之尿素會使秧苗產生黃化與生長遲緩等由氨所造成的毒害現象。然而，於水稻移植到盆栽中時，連續以WG6-14 FNF 50倍澆灌四週後並添加尿素，可觀察到良好的促進生長並增加植株葉綠素含量。檢視WG6-14防治可有效地防治由Sclerotium rolfsii所引起的秧苗立枯病，於PSA上進行對峙培養顯示出WG6-14對該病原真菌具有良好的拮抗能力，可產生的拮抗物質可抑制病原真菌菌絲生長，其菌絲浸於WG6-14培養過濾液，WG6-14的代謝物質可以造成真菌菌絲細胞膜完全喪失調節膜滲透的功能。在病害防治上，自田間收集已被Sclerotium rolfsii感染的秧苗盤，以WG6-14 50倍連續澆灌一週，於澆灌處理結束後第三天測量發病面積，在對照組平均增加4.92%，WG6-14處理組則平均增加之面積0.88%，另外在菌核數量方面，以WG6-14處理組也明顯較少。在密閉的培養皿中，檢測施用WG6-14與尿素對菌核活性的影響。單獨施用WG6-14 50倍對菌核活性沒有影響，單獨添加0.5%尿素，則可降低菌核活性到56.8%，而WG6-14與尿素共同施用，則可以降低菌核活性到零。然而，只在非滅菌土中對菌核殺傷力較為明顯。導致菌核死亡的作用機制尚需要進一步的探討與研究。結果中顯示枯草桿菌WG6-14醱酵液應用水稻秧苗生產及苗期立枯病之防治上皆有極大的發展潛力。
本研究的目的為利用拮抗性枯草桿菌Bacillus subtilis WG6-14防治苗期徒長病。將實驗室中所保存的TKS1-1, TLB7-7, SP4-17, BS-1, WP8-12 與 WG6-14等Bacillus spp.對徒長病原菌Fusarium moniliforme Fm01於PSA平板上進行對峙培養，其中以WG6-14有較好的拮抗性及良好的內生孢子產孢能力特點，選用來進行以下的試驗。經由實驗室中所生產的枯草桿菌WG6-14醱酵液 (≒1010 endospore/ml) 與經由開放系統下所生產的枯草桿菌功能性營養配方 (functional nutritive formulation, FNF) 以供防治病害試驗所用。以WG6-14醱酵液與與FNF100倍稀釋液替代化學藥劑來浸種處理稻種防治徒長病。以人工接種方式將稻種浸於徒長病原菌 (Fm01) 孢子懸浮液 (103conidia/ml)。與水處理組比較，以WG6-14醱酵液與FNF處理，皆可降低種子帶菌率，但不如撲克拉乳劑 (2000倍)處理來得低。接著以不同濃度的枯草桿菌WG6-14醱酵液做浸種處理，顯示出施用之枯草桿菌濃度必須高於50倍稀釋，其稻種帶菌率愈低，並愈接近化學藥劑處理的結果。將播種後苗徒長病率接近100%之帶菌稻種，以WG6-14醱酵液1X與10X 連續浸種處理三天，其發病率分別為1.6%與3.6%，跟化學藥劑處理組之結果相近。以將稻種播種於含102 conidia/gsoil帶菌土上，可以導致100%苗期徒長病發生。於此帶菌土中混入WG6-14醱酵液，使其帶菌土中每克土最終菌量為106 cfu，處理五天之病土於其上播下稻種，與水處理相較可降低20.7%發病率為。顯示WG6-14可以有效地降低土壤中F. moniliforme孢子殘存。WG6-14可以抑制徒長病原菌之分生孢子發芽與菌絲生長。在以WG6-14培養於523液態培養基之培養過濾液，取其處理徒長病原菌分生孢子，可導致細胞內的離子滲漏，並且造成90%的分生孢子死亡。在許多數據顯示枯草桿菌WG6-14在苗期徒長病害管理上是一相當好的生物製劑。
本研究目的是在水稻田間以生物防治來抑制水稻紋枯病及水稻白葉枯病的發生。利用從番石榴根圈土壤所分離得到的Bacillus subtilis WG6-14，對紋枯病原菌具有良好的拮抗能力，可分泌peptide一類之抗生物質對其菌絲生長具有良好的抑制效果，其抑制菌絲生長之作用機制乃是造成其細胞膜的破壞。於2005至2006年間，在台中市南屯區水稻田間，施用經WG6-14醱酵液擴大培養之功能性營養配方 (functional nutritive formulation, FNF; 1010 endosopre/ml)，將FNF隨灌溉水滴入試驗田中 (800 L/ha)。於2005年第一期稻作，施用於台稉8號 (TK8)與台農71號 (TN71)之結果，可以明顯地抑制紋枯病害的感染。在台稉8號方面，於收割期調查其發病率及病班高度，於在處理組分別為13.6 cm與46%，對照組分別為40.2 cm and 75.4%，在產量上無明顯差異，但在稔實率上以FNF處理組較好。在台農71號方面，FNF於病害防治上有優異的成果，於收割期調查病斑高度與發病率方面，在處理組各別為33.1 cm與65.6%；於對照組各別為86.6 cm與98.1%。於期間逼遇到龍王颱風，其因紋枯病所引起的倒伏率相當的嚴重，在FNF處理組，倒伏率為7.5%，對照組為85.5%，在產量與稔實率方面，FNF處理組各別為6,7 t/ha與79.7%，在對照組為6.2 t/ha與62.9%。在該期田間試驗中曾觀察到處理組，其植株有黃化的情形，並於溫室盆栽試驗證實，連續以WG6-14 FNF 50倍澆灌四週後，在以尿素添加，才能有良好的促進生長並增加植株葉綠素含量。在2005年第二期稻作於台稉8號實驗田有良好的結果呈現。因其間為分蘗盛期正值颱風季節，有不少的植株逼受到白葉枯病的感染，經由WG6-14 FNF 50X稀釋液葉噴於處理後，對紋枯病病斑高度與發病率之調查，於FNF處理組各別為7.5 cm與19.5%，在對照組各別為 36.2 cm與 71.1%。對白葉枯病的發病率方面，FNF處理組為40.4%，對照組則為69.7%，FNF處理組在產量與稔實率皆比對照組有增加的情形。在2006年於相同的實驗田將原本隨灌溉水滴灌處理改以葉噴方式處理，FNF 50倍於分蘗期間每二週施用一次。於成熟期調查紋枯病斑高度與發病率，在台稉8號方面，分別為7.5 cm 與19.5 %，在台農71號部分，分別為37.1 cm與10.4 %。在多次的田間試驗的數據清楚顯示，枯草桿菌WG6-14 FNF在水稻紋枯病與水稻白葉枯病之防治上為一有效的生物製劑。